Contaminazione delle colture di tessuti vegetali: cause, identificazione e prevenzione
La contaminazione è una delle sfide più comuni nella coltura in vitro di tessuti vegetali. Anche quando una coltura appare perfettamente pulita subito dopo l'inoculazione, batteri o funghi possono manifestarsi diversi giorni o addirittura settimane dopo.
Comprendere da dove proviene la contaminazione è una delle competenze più importanti che un coltivatore di tessuti vegetali può sviluppare.
La contaminazione proviene solitamente da uno di questi tre fattori: il materiale vegetale stesso, l'ambiente di lavoro o le attrezzature e i materiali utilizzati durante la coltura.
Contaminazione esterna
La superficie di una pianta ospita naturalmente microrganismi. Foglie, steli, radici e bulbi possono contenere spore fungine, batteri e altri microbi che sono innocui per la pianta all'aperto, ma diventano un serio problema all'interno di un contenitore di coltura ricco di nutrienti. Ecco perché gli espianti vengono sterilizzati superficialmente prima di essere introdotti in coltura. Il materiale vegetale che è cresciuto nel terreno è generalmente più difficile da sterilizzare rispetto al materiale prelevato da parti aeree più pulite.
Contaminazione interna
Alcuni microrganismi vivono all'interno dei tessuti vegetali anziché sulla superficie. Questi sono talvolta chiamati microrganismi endofiti. Poiché sono protetti all'interno della pianta, la sterilizzazione superficiale potrebbe non rimuoverli. Una coltura può quindi rimanere limpida per diversi giorni prima che i batteri inizino improvvisamente a crescere dall'espiante. Questo è uno dei motivi per cui stabilire una pianta madre pulita prima della coltura in vitro può migliorare significativamente i tassi di successo.
Contaminazione dall'ambiente di lavoro
L'aria contiene spore fungine, batteri e particelle di polvere. Ogni volta che viene aperto un contenitore di coltura, c'è la possibilità che i microrganismi vi entrino. Il rischio può essere ridotto lavorando all'interno di una cappa a flusso laminare o di uno spazio di lavoro a aria ferma adeguatamente preparato e mantenendo i contenitori di coltura aperti per il minor tempo possibile.
Contaminazione da strumenti
Bisturi, pinzette e altri strumenti devono essere sterili quando entrano in contatto con un espiante. Uno strumento che tocca una superficie non sterile può trasferire microrganismi direttamente in un contenitore di coltura. Una buona tecnica sterile prevede quindi di riflettere costantemente su quali superfici sono sterili e quali no.
Come appare la contaminazione?
I diversi contaminanti possono avere aspetti molto diversi.
Contaminazione batterica
I batteri spesso si presentano come:
- aree torbide nel terreno di coltura
- crescita bagnata o vischiosa attorno all'espiante
- pellicole traslucide
- colonie gialle, color crema o bianche
- rapido deterioramento del tessuto vegetale
Alcune contaminazioni batteriche sono estremamente sottili e inizialmente possono manifestarsi solo come una leggera foschia attorno alla base dell'espiante.
Contaminazione fungina
I funghi sono solitamente più facili da riconoscere.
I segni comuni includono:
- crescita bianca e lanuginosa
- muffa grigia o nera
- sottili strutture simili a fili
- colonie in rapida espansione
- spore colorate
Una singola colonia fungina può diffondersi su un intero contenitore sorprendentemente rapidamente.
Lieviti
La contaminazione da lieviti può manifestarsi come piccole colonie color crema o crescita torbida nel terreno di coltura. A volte può essere scambiata per contaminazione batterica.
Perché la contaminazione a volte appare tardi
Una coltura che appare pulita dopo tre giorni non è necessariamente sterile. I microrganismi possono essere presenti in numeri molto ridotti e hanno bisogno di tempo per moltiplicarsi prima di diventare visibili.
I batteri interni possono anche emergere gradualmente dal tessuto vegetale. Per questo motivo, le nuove colture dovrebbero normalmente essere osservate per diverse settimane prima di essere considerate affidabilmente pulite.
Come ridurre la contaminazione
Il controllo efficace della contaminazione si basa su diversi livelli di protezione:
- Usa piante madri sane ogni volta che possibile.
- Pulisci accuratamente il materiale vegetale prima della sterilizzazione.
- Usa una procedura di sterilizzazione superficiale appropriata per il tipo di espiante.
- Sterilizza correttamente i terreni di coltura e i contenitori.
- Lavora in un ambiente pulito.
- Sterilizza gli strumenti tra un espiante e l'altro.
- Minimizza il tempo in cui i contenitori di coltura rimangono aperti.
- Evita di toccare le superfici sterili.
- Tieni le colture contaminate lontane da quelle pulite.
Nessun protocollo di sterilizzazione funziona perfettamente per ogni specie. Un giovane germoglio tenero e un bulbo cresciuto nel terreno potrebbero richiedere trattamenti molto diversi.
L'obiettivo è trovare un equilibrio tra l'eliminazione dei microrganismi e il mantenimento in vita del tessuto vegetale.
Le colture contaminate dovrebbero essere salvate?
Nella maggior parte delle situazioni di coltura in vitro amatoriale, le colture pesantemente contaminate dovrebbero essere rimosse dall'area di coltivazione. Aprire un contenitore contaminato vicino a colture pulite può rilasciare spore fungine o batteri nello spazio di lavoro.
Se un espiante è particolarmente prezioso, a volte potrebbe essere possibile rimuovere il tessuto interno pulito e tentare un ripristino, ma ciò dovrebbe essere fatto con attenzione e separatamente dalle colture pulite.
La regola più importante
La contaminazione non è semplicemente un fallimento. Ogni coltura contaminata fornisce informazioni.
Registra:
- la specie vegetale
- il tipo di espiante
- il metodo di sterilizzazione
- la durata della sterilizzazione
- la data dell'inoculazione
- il tipo di contaminazione
- quanto tempo ci è voluto per manifestarsi
Con il tempo, questi registri rendono molto più facile migliorare il tuo protocollo.
