Come sterilizzare i terreni di coltura tissutale senza un'autoclave o una pentola a pressione?

Uno dei maggiori ostacoli per i principianti nella coltura di tessuti vegetali è la sterilizzazione. I laboratori professionali utilizzano solitamente un autoclave, mentre molti hobbisti usano una pentola a pressione.

Ma cosa fare se non si ha nessuno dei due?

È possibile eseguire alcune forme di coltura di tessuti senza un'autoclave o una pentola a pressione, sebbene le alternative presentino dei limiti.

Perché i terreni di coltura dei tessuti devono essere sterili?

I terreni di coltura per tessuti vegetali contengono solitamente:

• Zucchero
• Minerali
• Vitamine
• Acqua

Purtroppo, questo li rende anche un eccellente terreno di crescita per batteri, lieviti e funghi. Anche un numero esiguo di microrganismi può rapidamente prendere il sopravvento su un recipiente di coltura, pertanto la sterilità è essenziale.

Opzione 1: Filtrazione sterile (Terreni liquidi)

Per i terreni liquidi, la filtrazione sterile è una delle alternative più affidabili.

Un filtro a membrana, tipicamente di circa 0,22µm, può rimuovere la maggior parte dei batteri e delle cellule fungine da un terreno liquido preparato. Il terreno filtrato deve poi essere trasferito in recipienti sterili in condizioni di pulizia.

Un tipico flusso di lavoro appare così:

1. Prepara il liquido che vuoi sterilizzare.
2. Aspira quel liquido in una siringa sterile.
3. Collega un filtro per siringa sterile da 0,22 µm alla siringa.
4. Spingi il liquido attraverso il filtro.
5. Raccogli il liquido filtrato direttamente in un contenitore sterile.
6. Mantieni sterile tutto ciò che si trova a valle del filtro.

Questo metodo è particolarmente utile per:

• Soluzioni stock di regolatori di crescita delle piante
• Vitamine
• Composti termosensibili
• Terreni di coltura liquidi

Tuttavia, diventa più difficile con i terreni contenenti agar poiché la soluzione diventa viscosa man mano che si raffredda.

Opzione 2: Utilizzare recipienti pre-sterilizzati

Invece di cercare di sterilizzare ogni componente da soli, i principianti possono semplificare il processo utilizzando:

• Recipienti di coltura sterili
• Pipette sterili
• Filtri sterili
• Materiali di consumo pre-sterilizzati

Ciò riduce considerevolmente il numero di fonti di contaminazione.

Combinare la filtrazione sterile con attrezzature monouso sterili può rendere pratica la coltura liquida su piccola scala senza attrezzature a pressione.

Opzione 3: Sterilizzazione a vapore in una pentola normale (sterilizzazione frazionata)

Se non disponi di un'autoclave o di una pentola a pressione, puoi anche sterilizzare i terreni utilizzando il vapore di una normale pentola da cucina.

Posiziona i terreni preparati in recipienti o bottiglie di coltura resistenti al calore, tieni i coperchi leggermente allentati se appropriato per il recipiente e posizionali su una griglia o una piattaforma rialzata (anche le palline di fogli di alluminio funzionano) sopra una piccola quantità di acqua bollente. Copri la pentola con un coperchio e lascia che i recipienti siano esposti al vapore continuo.

Poiché il vapore normale raggiunge solo circa 100°C a pressione atmosferica, è meno affidabile del vapore pressurizzato a 121°C. Alcune spore batteriche potrebbero sopravvivere a un singolo trattamento. Per questo motivo, dovrebbero preferibilmente essere utilizzati cicli di vapore ripetuti.

Un approccio pratico è:

• Vaporizzare per circa 30–60 minuti
• Lasciare raffreddare e riposare i terreni per circa 24 ore
• Ripetere il processo di vaporizzazione
• Eseguire 2–3 cicli in totale

L'idea è che le spore sopravvissute possano germogliare durante il periodo di riposo e diventare più facili da uccidere durante il ciclo di riscaldamento successivo. Riducendo così significativamente la contaminazione a ogni ciclo.

Tuttavia, non è comunque affidabile quanto una corretta sterilizzazione a pressione.

Quando è adatto questo metodo?

Può essere utile per:

• Principianti che sperimentano con la coltura di tessuti
• Piccoli lotti
• Situazioni in cui non è disponibile una pentola a pressione
• Configurazioni domestiche a basso costo

Ma se miri a tassi di contaminazione costantemente bassi, una pentola a pressione o un'autoclave sono comunque preferibili.

Si possono bollire i terreni di coltura dei tessuti?

La bollitura può uccidere molti microrganismi, ma non distrugge in modo affidabile tutte le spore batteriche. Per questo motivo, la bollitura non è una vera sterilizzazione. Può funzionare in alcuni esperimenti hobbistici, ma i tassi di contaminazione sono solitamente più alti.

Se il tuo obiettivo è una coltura affidabile a lungo termine, la sola bollitura non è l'opzione migliore.

Si possono usare i forni a microonde per i terreni di coltura dei tessuti?

I microonde possono riscaldare i terreni rapidamente e ridurre la contaminazione microbica. Tuttavia, il riscaldamento a microonde è spesso irregolare poiché possono rimanere punti freddi, il che significa che alcuni microrganismi potrebbero sopravvivere. Il microonde dovrebbe quindi essere considerato un metodo a bassa affidabilità piuttosto che un sostituto dell'autoclave.

Che dire della sterilizzazione chimica?

Gli sterilizzanti chimici come la candeggina e l'alcol sono eccellenti per:

• Superfici di lavoro
• Strumenti
• Espianti

Non dovrebbero normalmente essere aggiunti direttamente ai terreni di coltura per tessuti vegetali standard.

I prodotti progettati per sopprimere la contaminazione possono talvolta essere utilizzati in protocolli specifici, ma gli additivi per il controllo della contaminazione non sostituiscono una corretta tecnica sterile.

L'approccio più semplice per principianti senza attrezzature a pressione

Per terreno liquido (senza agente gelificante)

1. Prepara il terreno liquido.
2. Regola il pH.
3. Filtra sterilmente il terreno.
4. Distribuiscilo in modo asettico in recipienti sterili.
5. Lavora all'interno di una camera a aria ferma (still-air box) o un ambiente a flusso laminare durante l'inoculazione dei terreni.
6. Usa strumenti e materiali di consumo sterili.

Per terreno solido (con agente gelificante):

1. Prepara il terreno
2. Regola il pH (regola il pH prima di aggiungere l'agente gelificante).
3. Sterilizza a vapore in una pentola normale per 2-3 cicli (lascia raffreddare per 24 ore tra i cicli).
4. Lavora all'interno di una camera a aria ferma (still-air box) o un ambiente a flusso laminare durante l'inoculazione dei terreni.
5. Usa strumenti e materiali di consumo sterili.

Vale la pena acquistare una pentola a pressione?

Per chiunque intenda eseguire la coltura di tessuti regolarmente, sì. Una pentola a pressione adatta è spesso uno dei più grandi aggiornamenti che un setup di coltura di tessuti domestico possa fare.

Ti consente di sterilizzare:

• Terreni di coltura
• Acqua
• Vetreria
• Strumenti
• Recipienti

in un unico processo.

Ma per i principianti che testano la coltura di tessuti per la prima volta, la filtrazione sterile e le forniture pre-sterilizzate possono offrire un punto di partenza alternativo.