Come sterilizzare gli espianti vegetali per la coltura di tessuti

L'espianto vegetale è solitamente la principale fonte di contaminazione quando si avvia una nuova coltura in vitro. Le piante portano naturalmente batteri, spore fungine e altri microrganismi sulle loro superfici. Lo scopo della sterilizzazione dell'espianto è ridurre tali microrganismi a sufficienza affinché il tessuto vegetale possa crescere senza contaminazioni. La difficoltà consiste nel fatto che il trattamento sterilizzante deve uccidere i microbi senza uccidere la pianta.

Inizia con materiale vegetale sano

La sterilizzazione inizia prima che l'espianto entri nell'ambiente di lavoro sterile. Una pianta madre sana fornisce un materiale di partenza migliore rispetto a una pianta stressata o malata.

Quando possibile, scegli:

• tessuto in fase di crescita attiva
• germogli giovani
• materiale privo di parassiti
• materiale privo di marciume visibile
• tessuto coltivato lontano dalla contaminazione del suolo

Le strutture sotterranee come radici, rizomi e tuberi sono generalmente più difficili da sterilizzare.

La pulizia non equivale alla sterilizzazione

Prima del trattamento chimico, rimuovi il maggior numero possibile di contaminanti fisici. 

Il materiale vegetale può essere lavato accuratamente con acqua e pulito da:

• terriccio
• tessuto morto
• detriti organici
• vecchie guaine fogliari

La rimozione di questo materiale rende più efficace la successiva fase di sterilizzazione.

Sterilizzazione superficiale

Gli agenti sterilizzanti comuni nelle colture in vitro includono l'etanolo e l'ipoclorito di sodio. L'etanolo può ridurre rapidamente i microrganismi superficiali, mentre le soluzioni diluite di ipoclorito di sodio (ovvero la candeggina) forniscono un trattamento disinfettante più prolungato. La concentrazione e il tempo di esposizione corretti dipendono fortemente dall'espianto. Il tessuto meristematico tenero può essere danneggiato da un trattamento che uno stelo legnoso e spesso tollera facilmente. Ecco perché i protocolli di sterilizzazione dovrebbero essere considerati come punti di partenza piuttosto che come ricette universali.

Risciacquo sterile

Dopo la sterilizzazione chimica, l'espianto viene trasferito nell'ambiente di lavoro sterile. Il disinfettante residuo viene rimosso utilizzando acqua sterile. Si usano comunemente risciacqui multipli per ridurre i residui chimici.

Potatura dopo la sterilizzazione

Le superfici esterne dell'espianto sono solitamente le più esposte sia ai contaminanti che ai prodotti chimici sterilizzanti. Una volta all'interno dell'ambiente di lavoro sterile, il tessuto esterno danneggiato può essere rimosso con strumenti sterili. Per le punte dei germogli, le guaine fogliari possono essere rimosse gradualmente fino a esporre un tessuto interno più pulito. Per i nodi, le estremità dello stelo possono essere potate nuovamente prima dell'inoculazione.

Le dimensioni dell'espianto sono importanti

Gli espianti molto grandi possono trasportare più contaminazioni. Gli espianti estremamente piccoli possono essere difficili da stabilire perché contengono meno risorse di riserva e sono più facilmente danneggiati. Per la coltivazione in vitro come hobby, mantenere una piccola quantità di tessuto sano attorno al meristema offre spesso un equilibrio pratico.

Piante diverse richiedono strategie diverse

Un metodo di sterilizzazione che funziona bene per la Monstera potrebbe non funzionare altrettanto bene per un'orchidea o un tubero di Alocasia.

I fattori che influenzano la sterilizzazione includono:

• spessore del tessuto
• consistenza della superficie
• presenza di peli
• se il tessuto è cresciuto sottoterra
• età dell'espianto
• carico microbico naturale

I migliori protocolli vengono normalmente sviluppati attraverso prove ripetute.

Tieni traccia

Quando avvii una nuova specie, registra il trattamento esatto.

Nota:

• metodo di pulizia
• concentrazione del disinfettante
• tempo di esposizione
• numero di risciacqui
• tipo di espianto
• sopravvivenza
• tasso di contaminazione

Se la maggior parte delle colture si contamina, il trattamento potrebbe dover essere reso più forte. 

Se la maggior parte degli espianti muore ma rimane pulita, il trattamento potrebbe essere troppo aggressivo.

L'obiettivo non è la massima sterilizzazione.

L'obiettivo è la massima sopravvivenza pulita.