Come preparare i terreni di coltura per tessuti vegetali in casa
Il terreno per coltura in vitro fornisce alle piante tutto ciò che normalmente otterrebbero dal terreno, dalle radici e dall'ambiente circostante. Un terreno tipico contiene nutrienti minerali, vitamine, zucchero, acqua e un agente gelificante. A seconda dello scopo della coltura, può contenere anche regolatori della crescita delle piante. Preparare correttamente i terreni è importante perché anche piccole differenze di concentrazione o di pH possono influenzare lo sviluppo delle piante.
I componenti di base
Sali basali
Uno dei terreni basali più utilizzati è il terreno Murashige e Skoog, comunemente chiamato terreno MS. MS fornisce importanti macro e micronutrienti, tra cui azoto, potassio, calcio, magnesio, fosforo, ferro e oligoelementi. Molte formulazioni commerciali includono anche vitamine.
Saccarosio
Le piante che crescono all'interno di contenitori per colture spesso non possono fare affidamento esclusivamente sulla fotosintesi. Il saccarosio fornisce una fonte di energia facilmente assimilabile. Una concentrazione di circa 20–30 g/L è comune in molti protocolli, sebbene la concentrazione ideale vari a seconda della specie e della fase della coltura.
Agar
L'agar trasforma il terreno liquido in un gel semisolido. Questo sostiene l'espianto pur consentendo ai nutrienti e all'acqua di rimanere disponibili. La quantità necessaria dipende dalla forza dell'agar utilizzato.
Regolatori della crescita delle piante
I regolatori della crescita delle piante (PGR) come BAP, NAA e IBA possono essere inclusi per influenzare la formazione dei germogli, la moltiplicazione o l'apparato radicale. Vengono utilizzati a concentrazioni molto basse e devono essere dosati con precisione.
Quale tipo di acqua utilizzare?
Per risultati costanti, è preferibile utilizzare acqua distillata, deionizzata o ottenuta per osmosi inversa. L'acqua del rubinetto può contenere quantità variabili di calcio, magnesio, bicarbonato, sodio e altri minerali disciolti. Questi minerali alterano la composizione finale del terreno. L'acqua del rubinetto dolce può funzionare in alcune situazioni, ma l'acqua purificata garantisce una migliore riproducibilità.
Preparazione del terreno
Iniziare con una quantità d'acqua leggermente inferiore al volume finale desiderato.
- Sciogliere completamente i sali basali e il saccarosio.
- Aggiungere gli altri componenti richiesti dalla formulazione (ovvero PGR e conservanti)
- Regolare il pH prima di aggiungere l'agar, se questo è il metodo utilizzato nel protocollo.
- Un pH di circa 5,6–5,8 è comunemente utilizzato per molte colture di tessuti vegetali.
- Dopo la regolazione del pH, portare la soluzione al volume finale.
- Aggiungere l'agar richiesto e distribuire il terreno nei contenitori per colture.
- Sterilizzare in autoclave o in pentola a pressione per 15 min a 15 PSI e lasciare raffreddare prima dell'inoculazione.
Sterilizzazione
Il terreno preparato deve essere sterilizzato prima di introdurre il materiale vegetale. L'autoclave è il metodo standard di laboratorio. Per la coltura in vitro domestica, viene comunemente utilizzata una pentola a pressione adeguata per ottenere condizioni di sterilizzazione a umido comparabili. Dopo la sterilizzazione, lasciare raffreddare i contenitori senza aprirli.
Perché il pH è importante
Il pH del terreno influenza:
- la disponibilità dei nutrienti
- la consistenza dell'agar
- la stabilità chimica
- la crescita delle piante
Un pH estremamente alto o basso può rendere alcuni nutrienti meno disponibili o influire sul modo in cui il terreno si solidifica.
Evitare gli errori comuni
I problemi comuni di preparazione includono:
- pesatura imprecisa
- volume finale errato
- dimenticare di regolare il pH
- usare troppo o troppo poco agar
- contaminare il terreno dopo la sterilizzazione
- confondere mg con g
- aggiungere in modo impreciso PGR concentrati
Per quantità molto piccole, le soluzioni madre possono rendere molto più facile il dosaggio preciso.
La costanza conta più della perfezione
Un grande vantaggio della coltura in vitro è la ripetibilità. Quando ogni lotto viene preparato nello stesso modo, diventa molto più facile determinare se i cambiamenti nella crescita delle piante sono causati dalla pianta stessa o dal terreno. Buoni registri sono quindi altrettanto preziosi di buoni ingredienti.
