Guida per principianti alla coltura di tessuti vegetali
Indice
- Cos'è la coltura in vitro delle piante?
- Perché funziona la coltura in vitro: la totipotenza delle piante
- Il processo di coltura in vitro dall'inizio alla fine
- Di cosa hai bisogno per iniziare la coltura in vitro a casa
- Comprendere i terreni di coltura in vitro
- Terreno MS, zucchero, agar e acqua
- Regolatori della crescita delle piante: auxine e citochinine
- Terreni per l'insediamento, la moltiplicazione e l'apparato radicale
- Scegliere il materiale vegetale giusto
- Preparare l'espianto
- Sterilizzazione e controllo delle contaminazioni
- Creare un ambiente di lavoro pulito
- Inoculare l'espianto
- Condizioni di coltura: luce e temperatura
- Insediamento e crescita iniziale
- Moltiplicazione e subcoltura
- Radicazione delle piantine
- Acclimatamento: trasferire le piante dalla coltura in vitro
- Problemi comuni della coltura in vitro
- Buone pratiche per una coltura in vitro di successo
Guida per principianti alla coltura in vitro delle piante
La coltura in vitro delle piante può sembrare complicata all'inizio. Ci sono termini sconosciuti, tecniche sterili, diversi terreni, regolatori della crescita delle piante e diverse fasi di sviluppo della pianta da comprendere.
Ma l'idea di base è sorprendentemente semplice: prendere un piccolo pezzo di tessuto vegetale, posizionarlo su un terreno nutritivo sterile e fornirgli le condizioni necessarie per crescere e diventare nuove piante.
Questa guida spiega l'intero processo dall'inizio alla fine.
1. Cos'è la coltura in vitro delle piante?
La coltura in vitro delle piante è un metodo per far crescere cellule, tessuti o piccole parti di piante in condizioni controllate e sterili. Invece di coltivare una pianta nel terreno, un piccolo pezzo della pianta—chiamato espianto—viene posizionato all'interno di un contenitore sterile su un terreno nutritivo preparato appositamente.
L'espianto può essere:
- apice vegetativo
- nodo
- meristema
- sezione di foglia
- sezione di stelo
- tessuto di cormo
- embrione
- altro tessuto vegetale in attiva crescita
Nelle condizioni corrette, quel piccolo pezzo di materiale vegetale può crescere, produrre germogli, formare radici e, infine, diventare una pianta completa.
La coltura in vitro è ampiamente utilizzata per:
- propagazione rapida delle piante
- produzione di un gran numero di piante geneticamente simili
- propagazione di cultivar rare o di valore
- conservazione
- produzione di piante libere da malattie
- ricerca
- orticoltura commerciale
Per i coltivatori hobbisti, offre un modo completamente nuovo di propagare piante che non può essere facilmente ottenuto con i normali talee.
2. Perché funziona la coltura in vitro: la totipotenza delle piante
Il principio biologico alla base della coltura in vitro è chiamato totipotenza.
Molte cellule vegetali conservano le informazioni genetiche necessarie per produrre un'intera pianta. In condizioni di crescita normali, una cellula in una foglia si comporta come una cellula fogliare e una cellula in una radice si comporta come una cellula radicale.
Tuttavia, all'interno della coltura in vitro, l'ambiente può essere modificato controllando:
- nutrienti
- zucchero
- regolatori della crescita delle piante
- luce
- temperatura
- umidità
è possibile incoraggiare le cellule vegetali a svilupparsi in nuovi modi. Alcuni tessuti possono produrre germogli direttamente. Altri possono prima formare una massa di cellule indifferenziate chiamata callo, che può successivamente produrre germogli o radici. La risposta esatta dipende fortemente dalla specie vegetale, dalla cultivar, dal tipo di espianto e dal terreno.
3. Il processo di coltura in vitro dall'inizio alla fine
La maggior parte della micropropagazione può essere compresa come una sequenza di fasi.
Il processo di base è:
Selezionare il materiale vegetale → Pulire e sterilizzare → Stabilire → Moltiplicare → Radicare → Acclimatare
Insediamento
Un piccolo espianto viene introdotto in coltura sterile. L'obiettivo principale è ottenere un tessuto sano e privo di contaminazioni.
Moltiplicazione
La pianta stabilizzata viene incoraggiata a produrre più nuovi germogli. Questi germogli possono essere successivamente separati e moltiplicati di nuovo.
Radicazione
I singoli germogli vengono trasferiti in condizioni che favoriscono lo sviluppo delle radici.
Acclimatamento
Le piantine radicate vengono rimosse dalla coltura sterile e gradualmente adattate alle normali condizioni di crescita. Queste fasi sono importanti perché un singolo terreno è raramente ideale per ogni parte del processo.
4. Di cosa hai bisogno per iniziare la coltura in vitro a casa
Un laboratorio professionale utilizza attrezzature specializzate, ma i principianti non hanno bisogno di un intero laboratorio per iniziare ad imparare. I requisiti essenziali sono relativamente semplici.
Hai bisogno di:
- contenitori per coltura
- terreno nutritivo
- agar o un altro agente gelificante
- acqua sterile o purificata
- una pentola a pressione o un'autoclave
- bisturi
- pinzette
- un'area di lavoro pulita
- disinfettanti
- misurazione del pH
- attrezzature di misurazione precise
- materiale vegetale sano
Una cappa a flusso laminare rende più facile il lavoro sterile, ma i principianti spesso iniziano a utilizzare una scatola per aria ferma ben progettata.
Le cose più importanti non sono le attrezzature costose.
Sono:
tecnica pulita, sterilizzazione affidabile, preparazione accurata dei terreni e osservazione attenta.
5. Comprendere i terreni di coltura in vitro
Le piante che crescono nel terreno ricevono acqua e minerali attraverso le radici. Le piante che crescono all'interno dei contenitori per coltura in vitro hanno bisogno che queste risorse vengano fornite direttamente attraverso il terreno.
Un tipico terreno di coltura in vitro delle piante contiene:
- nutrienti minerali
- vitamine
- zucchero
- acqua
- un agente gelificante
- a volte regolatori della crescita delle piante
Il terreno diventa essenzialmente l'ambiente di crescita artificiale controllato della pianta. Diversi terreni possono essere progettati per incoraggiare risposte diverse.
Ad esempio:
- il terreno per l'insediamento sostiene la sopravvivenza iniziale
- il terreno per la moltiplicazione incoraggia la produzione di germogli
- il terreno per la radicazione incoraggia lo sviluppo delle radici
La composizione corretta dipende dalla pianta.
6. Terreno MS, zucchero, agar e acqua
Uno dei terreni basali più comunemente usati nella coltura in vitro delle piante è il terreno Murashige e Skoog, solitamente abbreviato in terreno MS.
Il terreno MS contiene importanti macro e micronutrienti di cui le piante hanno bisogno per crescere.
Questi includono nutrienti come:
- azoto
- potassio
- calcio
- magnesio
- fosforo
- ferro
- oligoelementi
Molte formulazioni MS contengono anche vitamine.
Zucchero
Le piante all'interno dei contenitori per coltura spesso non possono fotosintetizzare in modo sufficientemente efficiente per soddisfare tutti i loro fabbisogni energetici. Per questo motivo, viene comunemente aggiunto saccarosio.
Una concentrazione tipica in molti protocolli di coltura in vitro delle piante è di circa:
20–30 g/L di saccarosio
Agar
L'agar trasforma la soluzione nutritiva liquida in un gel. Questo consente all'espianto di rimanere sostenuto pur avendo accesso a nutrienti e acqua. A seconda del prodotto di agar e della consistenza desiderata, molti terreni utilizzano circa:
6–8 g/L di agar
Acqua
Per la riproducibilità, è preferibile l'acqua purificata.
Le opzioni comuni includono:
- acqua distillata
- acqua deionizzata
- acqua a osmosi inversa
L'acqua del rubinetto può contenere quantità variabili di minerali e sali che possono alterare la composizione finale del terreno.
7. Regolatori della crescita delle piante: auxine e citochinine
I regolatori della crescita delle piante, o PGR, sono composti che influenzano lo sviluppo delle piante. Due dei gruppi più importanti nella coltura in vitro sono:
Citochinine e Auxine.
Citochinine
Le citochinine generalmente incoraggiano:
- divisione cellulare
- formazione di germogli
- attivazione delle gemme dormienti
- moltiplicazione
Una citochinina comunemente usata è:
BAP — 6-Benzilamminopurina
La BAP è ampiamente utilizzata nei terreni di moltiplicazione perché può incoraggiare la formazione di germogli aggiuntivi.
Auxine
Le auxine sono comunemente coinvolte in:
- formazione delle radici
- espansione cellulare
- sviluppo del callo
- differenziazione dei tessuti
Le auxine comuni includono:
NAA — Acido 1-naftalenacetico
e
IBA — Acido indol-3-butirrico
L'IBA è particolarmente noto per incoraggiare la formazione delle radici.
Il concetto importante non è semplicemente quale PGR è presente. Il rapporto tra auxine e citochinine può influenzare fortemente il modo in cui la pianta risponde.
Un modello semplificato è:
Maggiore influenza delle citochinine → maggiore formazione di germogli
Rapporto equilibrato auxine/citochinine → callo o crescita mista
Maggiore influenza delle auxine → maggiore sviluppo delle radici
Le risposte reali delle piante sono più complicate, ma questo è un utile punto di partenza.
8. Terreni per l'insediamento, la moltiplicazione e la radicazione
Le diverse fasi della coltura in vitro richiedono condizioni diverse.
Terreno per l'insediamento
L'obiettivo è aiutare il tessuto appena sterilizzato a sopravvivere e iniziare a crescere.
L'espianto può essere stressato da:
- taglio
- sterilizzazione chimica
- perdita delle radici
- perdita delle foglie
Per questo motivo, l'insediamento si concentra solitamente sulla sopravvivenza e sulla crescita sana piuttosto che sulla massima moltiplicazione.
Terreno per la moltiplicazione
Una volta stabilita una coltura pulita, l'obiettivo cambia. La pianta viene ora incoraggiata a produrre germogli aggiuntivi.
Le citochinine come la BAP sono spesso utilizzate in modo più marcato in questa fase.
Terreno per la radicazione
Una volta prodotti germogli sufficienti, i singoli germogli vengono trasferiti in condizioni di radicazione. L'influenza delle citochinine viene solitamente ridotta e possono essere introdotte auxine come l'IBA. L'obiettivo è produrre piantine forti e indipendenti prima dell'acclimatamento.
9. Scegliere il materiale vegetale giusto
La qualità della pianta originale ha un effetto importante sul successo della coltura in vitro.
Scegliere materiale da una pianta che sia:
- sana
- in attiva crescita
- priva di parassiti
- priva di marciume
- ben idratata
- non gravemente stressata
Il tessuto giovane in attiva crescita è spesso più facile da stabilizzare rispetto al materiale legnoso vecchio.
I buoni espianti includono:
- apici vegetativi
- nodi
- gemme ascellari
- tessuto meristematico
Il materiale vegetale che è stato a contatto con il terreno spesso trasporta significativamente più microrganismi.
Gli esempi includono:
- radici
- rizomi
- cormi
- fusti sotterranei
Questi possono comunque essere coltivati, ma la contaminazione può essere più difficile da controllare.
10. Preparare l'espianto
Prima della sterilizzazione, rimuovere il materiale vegetale non necessario.
Ad esempio, con uno stelo o un germoglio:
- rimuovere le foglie grandi
- rimuovere il materiale morto
- tagliare via il tessuto danneggiato
- rimuovere terra visibile o detriti
- accorciare i pezzi eccessivamente grandi
L'obiettivo è creare un espianto gestibile senza tagliare così tanto da rendere il tessuto troppo debole. Gli espianti più grandi tendono a sopravvivere più facilmente ma possono trasportare più contaminazione. Gli espianti molto piccoli sono spesso più puliti ma possono essere più difficili da stabilizzare.
Per i principianti, è solitamente più facile mantenere una piccola quantità di tessuto sano attorno al punto di crescita piuttosto che cercare di isolare un meristema microscopico.
11. Sterilizzazione e controllo delle contaminazioni
La contaminazione è una delle principali sfide della coltura in vitro. Le piante trasportano naturalmente batteri, funghi, lieviti e altri microrganismi. Poiché il terreno di coltura in vitro contiene zucchero e nutrienti, i microrganismi possono crescere estremamente rapidamente una volta introdotti. La sterilizzazione superficiale mira a uccidere i microrganismi sull'espianto senza uccidere il tessuto vegetale.
Gli agenti sterilizzanti comuni includono:
- etanolo
- ipoclorito di sodio
- perossido di idrogeno in alcuni protocolli
Un tipico processo di sterilizzazione prevede:
pulire → disinfettare → sciacquare → potare → inoculare
La forza e la durata esatte della sterilizzazione dipendono dalla pianta. Il tessuto tenero necessita di un trattamento più delicato rispetto al tessuto spesso o cresciuto nel terreno. Non esiste un protocollo di sterilizzazione universale che funzioni perfettamente per ogni pianta.
12. Creare un ambiente di lavoro pulito
Dopo la sterilizzazione superficiale, l'espianto deve essere maneggiato in un ambiente pulito. Anche il materiale vegetale sterile può contaminarsi rapidamente se esposto a microrganismi trasportati dall'aria. I laboratori professionali utilizzano solitamente una cappa a flusso laminare, mentre i coltivatori domestici possono utilizzare una scatola per aria ferma.
Prima di lavorare:
- disinfettare la superficie di lavoro
- pulire le mani
- disinfettare i guanti se usati
- sterilizzare gli strumenti
- ridurre la polvere e il movimento dell'aria
- preparare tutto prima di aprire le colture
Una volta iniziato il lavoro sterile, evitare di toccare:
- i bordi dei barattoli
- i terreni sterili
- le punte degli strumenti sterili
- le superfici interne dei contenitori
Lavorare in modo efficiente e tenere aperti i contenitori per il minor tempo possibile.
13. Inoculare l'espianto
L'inoculazione significa semplicemente trasferire il tessuto vegetale sterilizzato sul terreno di coltura sterile. Usare pinzette sterili e un bisturi sterile. Posizionare l'espianto in modo che il tessuto appropriato tocchi il terreno.
Per molte colture di apici vegetativi o nodi:
- la superficie di taglio basale tocca il terreno
- il punto di crescita rimane sopra il terreno
Evitare di seppellire l'intero espianto.
Dopo il posizionamento, chiudere immediatamente il contenitore. La coltura entra ora nella fase di insediamento.
Etichettare il contenitore con informazioni come:
- nome della pianta
- tipo di espianto
- terreno
- data
- concentrazione di PGR
- trattamento di sterilizzazione
Una buona etichettatura diventa estremamente importante una volta che si hanno molte colture.
14. Condizioni di coltura: luce e temperatura
Dopo l'inoculazione, le colture necessitano di condizioni ambientali stabili. Per molte piante da appartamento tropicali, un intervallo di partenza ragionevole è intorno a 23–26°C.
La luce dovrebbe essere solitamente luminosa ma non intensa. Molte colture performano bene sotto circa 12–16 ore di luce al giorno. La luce solare diretta dovrebbe essere evitata perché i contenitori per coltura sigillati possono surriscaldarsi molto rapidamente. I requisiti di luce variano tra le piante. Alcuni espianti traggono anche beneficio da un breve periodo di luce più bassa durante la primissima fase di insediamento.
La cosa più importante è la costanza. Grandi fluttuazioni di temperatura o luce possono stressare le colture.
15. Insediamento e crescita iniziale
Il primo obiettivo dopo l'inoculazione non è la rapida moltiplicazione. È semplicemente ottenere una coltura pulita e viva. Durante le prime settimane, osservare l'espianto attentamente.
Un espianto di successo può:
- rimanere verde
- gonfiarsi
- attivare una gemma dormiente
- produrre un nuovo germoglio
- sviluppare nuove foglie
Alcuni espianti crescono molto lentamente all'inizio. Non presumere il fallimento semplicemente perché non succede nulla durante i primi giorni. Allo stesso tempo, osservare attentamente la contaminazione. Una coltura può sembrare perfettamente pulita all'inizio e sviluppare contaminazione in seguito.
16. Moltiplicazione e subcoltura
Una volta che la coltura è pulita e in attiva crescita, può essere spostata nel terreno di moltiplicazione. I terreni di moltiplicazione sono progettati per incoraggiare più germogli. Nel tempo, un espianto originale può produrre diversi germogli. Questi germogli possono poi essere divisi e trasferiti in nuovi contenitori. Questo processo è chiamato subcoltura.
Ad esempio:
- 1 pianta produce 4 germogli.
- Quei 4 germogli vengono divisi
- Ogni germoglio produce altri 4 germogli
Il numero di piante può aumentare rapidamente con cicli di moltiplicazione ripetuti. Tuttavia, una pressione di moltiplicazione eccessiva non è sempre benefica.
Troppa citochinina può causare:
- crescita molto compatta
- scarsa elongazione
- foglie anormali
- iperidricità
- germogli deboli
Una moltiplicazione sana è più importante della massima moltiplicazione.
17. Radicamento delle plantule
I germogli prodotti durante la moltiplicazione necessitano solitamente di un apparato radicale prima dell'acclimatazione. I germogli sani vengono trasferiti su un substrato di radicamento.
I substrati di radicamento spesso contengono:
- livelli più bassi di citochinina
- livelli complessivi ridotti di fitormoni
- un'auxina come l'IBA
Con il tempo, le radici dovrebbero emergere dal tessuto basale.
Una plantula pronta per l'acclimatazione idealmente presenta:
- diverse foglie
- un punto di crescita attivo
- radici sane multiple
- dimensioni sufficienti per essere maneggiata fuori dal contenitore
Le plantule molto deboli o minuscole sono più difficili da acclimare con successo.
18. Acclimatazione: spostare le piante dalla coltura in vitro
L'acclimatazione è una delle fasi più importanti.
All'interno di un contenitore di coltura, le piante sperimentano:
- umidità estremamente elevata
- accesso costante all'acqua
- movimento d'aria limitato
- bassa esposizione microbica
- zucchero nel terreno
Una stanza normale o una serra sono molto diverse. Rimuovere la pianta direttamente dal contenitore e posizionarla in aria secca può causare una rapida disidratazione. Iniziate rimuovendo con cura la plantula dal contenitore. Pulite delicatamente l'agar dalle radici. Piantate la plantula in un substrato leggero e arioso.
Un buon substrato di acclimatazione dovrebbe fornire:
- umidità
- ossigeno
- drenaggio
- supporto fisico
Inizialmente, mantenete un'alta umidità utilizzando:
- contenitori per l'umidità
- cupole per la propagazione
- contenitori trasparenti
Poi aumentate gradualmente la ventilazione.
Con il tempo, la pianta si adatta all'umidità normale. Le nuove foglie prodotte durante l'acclimatazione sono spesso meglio adattate alle normali condizioni di crescita rispetto alle foglie prodotte all'interno del contenitore di coltura.
19. Problemi comuni della coltura in vitro
Non tutti i problemi sono contaminazioni. Comprendere i sintomi più comuni rende molto più facile la risoluzione dei problemi.
Contaminazione batterica
Può manifestarsi come:
- terreno torbido
- bava
- crescita bagnata
- colonie color crema o gialle
Contaminazione fungina
Spesso si manifesta come:
- crescita bianca e lanuginosa
- muffa grigia
- muffa nera
- crescita filamentosa
Imbrunimento
Il tessuto vegetale può rilasciare composti fenolici dopo il taglio. L'ossidazione può causare l'imbrunimento del tessuto e del terreno, e un imbrunimento grave può danneggiare l'espianto.
Iperidricità
Le piante iperidriche possono apparire:
- vitree
- traslucide
- gonfie
- acquose
- fragili
Le possibili cause includono:
- eccesso di citochinina
- eccesso di umidità
- scambio gassoso insufficiente
- terreno eccessivamente morbido
Ingiallimento
Le possibili cause includono:
- squilibrio nutrizionale
- terreno invecchiato
- pH inadatto
- stress luminoso
- scarsa funzione radicale
Crescita bloccata
Le possibili cause includono:
- rapporto errato dei fitormoni
- terreno esaurito
- temperatura inadatta
- illuminazione insufficiente
- stress
- contaminazione nascosta
Considerate sempre diversi fattori prima di decidere cosa ha causato un problema.
20. Buone pratiche per una coltura in vitro di successo
La coltura in vitro è in parte scienza e in parte osservazione attenta. I principianti spesso migliorano rapidamente semplicemente tenendo buoni registri.
Annotate:
- specie vegetale
- cultivar
- tipo di espianto
- metodo di sterilizzazione
- durata della sterilizzazione
- composizione del terreno
- concentrazioni dei fitormoni
- data di inoculazione
- data del subcoltura
- contaminazione
- risposta di crescita
Quando si testa un nuovo protocollo, cambiate una variabile alla volta ogni volta che è possibile. Se cambiate contemporaneamente il terreno, il tempo di sterilizzazione, la temperatura e la concentrazione dei fitormoni, non saprete quale cambiamento ha causato il risultato. Ricordate anche che le piante diverse si comportano in modo diverso. Un protocollo che funziona perfettamente per la Monstera potrebbe avere prestazioni scarse con l'Alocasia. Anche le cultivar all'interno della stessa specie possono rispondere in modo diverso.
La mentalità più utile è quindi:
osserva → registra → aggiusta → ripeti
La coltura in vitro di successo non consiste nel non perdere mai una coltura. Consiste nel capire perché le colture si comportano in un certo modo e nel migliorare gradualmente il proprio processo.
Panoramica finale
Se ricordate solo una cosa da questa guida, ricordate la sequenza complessiva:
Materiale vegetale sano
↓
Pulire e sterilizzare
↓
Stabilire una coltura pulita
↓
Moltiplicare germogli sani
↓
Sviluppare radici forti
↓
Acclimatare gradualmente
↓
Crescere come una pianta normale
Una volta compresa questa progressione, i molti terreni, fitormoni, strumenti e protocolli diversi diventano molto più facili da comprendere. La coltura in vitro può sembrare inizialmente una tecnica di laboratorio complicata, ma ogni singolo passaggio ha uno scopo semplice. Padroneggiate quei passaggi uno alla volta, tenete buoni registri e i vostri risultati miglioreranno costantemente.
