Contamination des cultures de tissus végétaux : causes, identification et prévention
La contamination est l’un des principaux défis de la culture in vitro de tissus végétaux. Même si une culture semble parfaitement propre immédiatement après l’inoculation, des bactéries ou des champignons peuvent apparaître plusieurs jours, voire plusieurs semaines plus tard.
Comprendre d’où provient la contamination est l’une des compétences les plus importantes qu’un cultivateur de tissus végétaux puisse développer.
La contamination provient généralement de l’un de ces trois éléments : le matériel végétal lui-même, l’environnement de travail ou les équipements et matériaux utilisés pendant la culture.
Contamination externe
La surface d’une plante porte naturellement des micro-organismes. Les feuilles, les tiges, les racines et les tubercules peuvent contenir des spores fongiques, des bactéries et d’autres microbes qui sont inoffensifs pour la plante en extérieur, mais qui posent un sérieux problème à l’intérieur d’un récipient de culture riche en nutriments. C’est pourquoi les explants sont stérilisés en surface avant d’être introduits en culture. Le matériel végétal ayant poussé en terre est généralement plus difficile à stériliser que le matériel prélevé sur des parties aériennes plus propres.
Contamination interne
Certains micro-organismes vivent à l’intérieur des tissus végétaux plutôt que sur leur surface. On les appelle parfois micro-organismes endophytes. Comme ils sont protégés à l’intérieur de la plante, la stérilisation en surface peut ne pas les éliminer. Une culture peut donc rester claire pendant plusieurs jours avant que des bactéries ne commencent soudainement à se développer à partir de l’explant. C’est l’une des raisons pour lesquelles l’obtention d’une plante mère propre avant la culture in vitro peut considérablement améliorer les taux de réussite.
Contamination par l’environnement de travail
L’air contient des spores fongiques, des bactéries et des particules de poussière. Chaque fois qu’un récipient de culture est ouvert, des micro-organismes peuvent y pénétrer. Le risque peut être réduit en travaillant dans une hotte à flux laminaire ou dans un espace de travail à air immobile correctement préparé, et en gardant les récipients de culture ouverts le moins longtemps possible.
Contamination par les outils
Les scalpels, pinces et autres outils doivent être stériles lorsqu’ils entrent en contact avec un explant. Un outil qui touche une surface non stérile peut transférer des micro-organismes directement dans un récipient de culture. Une bonne technique stérile implique donc de réfléchir constamment aux surfaces qui sont stériles et à celles qui ne le sont pas.
À quoi ressemble la contamination ?
Différents contaminants peuvent avoir des apparences très différentes.
Contamination bactérienne
Les bactéries apparaissent souvent sous forme de :
- zones troubles dans le milieu
- croissance humide ou visqueuse autour de l’explant
- films translucides
- colonies jaunes, crème ou blanches
- détérioration rapide des tissus végétaux
Certaines contaminations bactériennes sont extrêmement subtiles et peuvent initialement n’apparaître que sous la forme d’un léger voile autour de la base de l’explant.
Contamination fongique
Les champignons sont généralement plus faciles à reconnaître.
Les signes courants comprennent :
- croissance blanche et duveteuse
- moisissure grise ou noire
- fines structures filamenteuses
- colonies à expansion rapide
- spores colorées
Une seule colonie fongique peut se propager à tout un récipient avec une rapidité surprenante.
Levures
La contamination par les levures peut se manifester sous forme de petites colonies de couleur crème ou d’une croissance trouble dans le milieu. Elle peut parfois être confondue avec une contamination bactérienne.
Pourquoi la contamination apparaît-elle parfois tardivement
Une culture qui semble propre après trois jours n’est pas nécessairement stérile. Des micro-organismes peuvent être présents en très faible nombre et avoir besoin de temps pour se multiplier avant de devenir visibles.
Des bactéries internes peuvent également émerger progressivement des tissus végétaux. Pour cette raison, les nouvelles cultures doivent normalement être observées pendant plusieurs semaines avant d’être considérées comme fiablement propres.
Comment réduire la contamination
La maîtrise efficace de la contamination repose sur plusieurs niveaux de protection :
- Utilisez des plantes mères saines dans la mesure du possible.
- Nettoyez soigneusement le matériel végétal avant la stérilisation.
- Utilisez une procédure de stérilisation en surface adaptée au type d’explant.
- Stérilisez correctement les milieux de culture et les récipients.
- Travaillez dans un environnement propre.
- Stérilisez les outils entre chaque explant.
- Limitez le temps pendant lequel les récipients de culture restent ouverts.
- Évitez de toucher les surfaces stériles.
- Éloignez les cultures contaminées des cultures propres.
Aucun protocole de stérilisation ne fonctionne parfaitement pour toutes les espèces. Un jeune rameau tendre et un tubercule ayant poussé en terre peuvent nécessiter des traitements très différents.
L’objectif est de trouver un équilibre entre l’élimination des micro-organismes et le maintien en vie des tissus végétaux.
Faut-il conserver les cultures contaminées ?
Dans la plupart des situations de culture in vitro amateur, les cultures fortement contaminées doivent être retirées de la zone de culture. Ouvrir un récipient contaminé à proximité de cultures propres peut libérer des spores fongiques ou des bactéries dans l’espace de travail.
Si un explant est particulièrement précieux, il peut parfois être possible de retirer les tissus internes propres et de tenter une réimplantation, mais cela doit être fait avec précaution et séparément des cultures propres.
La règle la plus importante
La contamination n’est pas simplement un échec. Chaque culture contaminée fournit des informations.
Notez :
- l’espèce végétale
- le type d’explant
- la méthode de stérilisation
- la durée de la stérilisation
- la date d’inoculation
- le type de contamination
- le temps nécessaire pour qu’elle apparaisse
Au fil du temps, ces notes vous permettront d’améliorer votre protocole beaucoup plus facilement.
