Comment stériliser des milieux de culture tissulaire sans autoclave ni autocuiseur ?

L'un des plus grands obstacles pour les débutants en culture de tissus végétaux est la stérilisation. Les laboratoires professionnels utilisent généralement un autoclave, tandis que de nombreux amateurs utilisent une cocotte-minute.

Mais que faire si vous n'avez ni l'un ni l'autre ?

Il est possible d'effectuer certaines formes de culture de tissus sans autoclave ni cocotte-minute, bien que les alternatives aient leurs limites.

Pourquoi les milieux de culture de tissus doivent-ils être stériles ?

Les milieux de culture de tissus végétaux contiennent généralement :

• Du sucre
• Des minéraux
• Des vitamines
• De l'eau

Malheureusement, cela en fait également un excellent milieu de croissance pour les bactéries, les levures et les champignons. Même un nombre infime de micro-organismes peut rapidement envahir un récipient de culture ; la stérilité est donc essentielle.

Option 1 : Filtration stérile (Milieux liquides)

Pour les milieux liquides, la filtration stérile est l'une des alternatives les plus fiables.

Un filtre à membrane, généralement d'environ 0,22µm, peut éliminer la plupart des bactéries et des cellules fongiques d'un milieu liquide préparé. Le milieu filtré doit ensuite être transféré dans des récipients stériles dans des conditions propres.

Un flux de travail typique ressemble à ceci :

1. Préparez le liquide que vous souhaitez stériliser.
2. Aspirez ce liquide dans une seringue stérile.
3. Fixez un filtre à seringue stérile de 0,22 µm à la seringue.
4. Poussez le liquide à travers le filtre.
5. Recueillez le liquide filtré directement dans un récipient stérile.
6. Maintenez tout ce qui se trouve en aval du filtre stérile.

Cette méthode est particulièrement utile pour :

• Les solutions mères de régulateurs de croissance des plantes
• Les vitamines
• Les composés sensibles à la chaleur
• Les milieux de culture liquides

Cependant, cela devient plus difficile avec les milieux contenant de l'agar, car la solution devient visqueuse en refroidissant.

Option 2 : Utiliser des récipients pré-stérilisés

Au lieu d'essayer de stériliser chaque composant vous-même, les débutants peuvent simplifier le processus en utilisant :

• Des récipients de culture stériles
• Des pipettes stériles
• Des filtres stériles
• Des consommables pré-stérilisés

Cela réduit considérablement le nombre de sources de contamination.

Combiner la filtration stérile avec du matériel jetable stérile peut rendre la culture liquide à petite échelle pratique sans équipement sous pression.

Option 3 : Stérilisation à la vapeur dans une casserole normale (stérilisation fractionnée)

Si vous n'avez pas d'autoclave ou de cocotte-minute, vous pouvez également stériliser les milieux en utilisant de la vapeur provenant d'une casserole de cuisine normale.

Placez les milieux préparés dans des récipients ou des bouteilles de culture résistants à la chaleur, gardez les couvercles légèrement desserrés si cela est approprié pour le récipient, et placez-les sur une grille ou une plateforme surélevée (des boules de papier aluminium fonctionnent également) au-dessus d'une petite quantité d'eau bouillante. Couvrez la casserole avec un couvercle et laissez les récipients exposés à une vapeur continue.

Parce que la vapeur normale n'atteint qu'environ 100°C à pression atmosphérique, elle est moins fiable que la vapeur sous pression à 121°C. Certaines spores bactériennes peuvent survivre à un seul traitement. C'est pourquoi des cycles de vapeur répétés devraient être utilisés de préférence.

Une approche pratique consiste à :

• Passer à la vapeur pendant environ 30 à 60 minutes
• Laisser le milieu refroidir et reposer pendant environ 24 heures
• Répéter le processus de vapeur
• Effectuer 2 à 3 cycles au total

L'idée est que les spores survivantes peuvent germer pendant la période de repos et devenir plus faciles à éliminer lors du cycle de chauffage suivant. Réduisant ainsi la contamination de manière significative à chaque cycle.

Cependant, ce n'est toujours pas aussi fiable qu'une véritable stérilisation sous pression.

Quand cette méthode est-elle appropriée ?

Elle peut être utile pour :

• Les débutants expérimentant la culture de tissus
• Les petits lots
• Les situations où aucune cocotte-minute n'est disponible
• Les installations domestiques à faible coût

Mais si vous visez des taux de contamination systématiquement bas, une cocotte-minute ou un autoclave reste préférable.

Peut-on faire bouillir les milieux de culture de tissus ?

L'ébullition peut tuer de nombreux micro-organismes, mais elle ne détruit pas de manière fiable toutes les spores bactériennes. Pour cette raison, l'ébullition n'est pas une véritable stérilisation. Cela peut fonctionner pour certaines expériences amateurs, mais les taux de contamination sont généralement plus élevés.

Si votre objectif est une culture fiable à long terme, l'ébullition seule n'est pas la meilleure option.

Peut-on utiliser un micro-ondes pour les milieux de culture de tissus ?

Les micro-ondes peuvent chauffer rapidement les milieux et réduire la contamination microbienne. Cependant, le chauffage au micro-ondes est souvent inégal, car des points froids peuvent subsister, ce qui signifie que certains micro-organismes peuvent survivre. Le micro-ondes doit donc être considéré comme une méthode à faible fiabilité plutôt que comme un remplacement de l'autoclave.

Qu'en est-il de la stérilisation chimique ?

Les agents stérilisants chimiques tels que l'eau de Javel et l'alcool sont excellents pour :

• Les surfaces de travail
• Les outils
• Les explants

Ils ne doivent normalement pas être ajoutés directement aux milieux de culture de tissus végétaux standard.

Les produits conçus pour supprimer la contamination peuvent parfois être utilisés dans des protocoles spécifiques, mais les additifs de contrôle de la contamination ne remplacent pas une technique stérile appropriée.

L'approche la plus simple pour les débutants sans équipement sous pression

Pour un milieu liquide (sans agent gélifiant)

1. Préparez le milieu liquide.
2. Ajustez le pH.
3. Filtrez le milieu de manière stérile.
4. Distribuez-le de manière aseptique dans des récipients stériles.
5. Travaillez à l'intérieur d'une boîte à air calme (still-air box) ou dans un environnement à flux laminaire lors de l'inoculation des milieux.
6. Utilisez des outils et des consommables stériles.

Pour un milieu solide (avec agent gélifiant) :

1. Préparez le milieu
2. Ajustez le pH (ajustez le pH avant d'ajouter l'agent gélifiant).
3. Stérilisez à la vapeur dans une casserole normale pendant 2 à 3 cycles (laissez refroidir pendant 24h entre les cycles).
4. Travaillez à l'intérieur d'une boîte à air calme (still-air box) ou dans un environnement à flux laminaire lors de l'inoculation des milieux.
5. Utilisez des outils et des consommables stériles.

Une cocotte-minute vaut-elle l'investissement ?

Pour quiconque prévoit de pratiquer régulièrement la culture de tissus, oui. Une cocotte-minute adaptée est souvent l'une des meilleures améliorations qu'une installation de culture de tissus à domicile puisse apporter.

Elle vous permet de stériliser :

• Les milieux de culture
• L'eau
• La verrerie
• Les outils
• Les récipients

en un seul processus.

Mais pour les débutants qui testent la culture de tissus pour la première fois, la filtration stérile et les fournitures pré-stérilisées peuvent offrir un point de départ alternatif.