Miten kudosviljelyalusta steriloidaan ilman autoklaavia tai painekattilaa?

Yksi suurimmista esteistä kasvukudosviljelyn aloittelijoille on sterilointi. Ammattilaislaboratorioissa käytetään tavallisesti autoklaavia, kun taas monet harrastajat käyttävät painekeitintä.

Mutta entä jos sinulla ei ole kumpaakaan?

Kudosviljelyn tiettyjä muotoja on mahdollista harjoittaa ilman autoklaavia tai painekeitintä, vaikka vaihtoehdoilla onkin rajoituksensa.

Miksi kudosviljelyalustan on oltava steriili?

Kasvikudosviljelyalusta sisältää yleensä:

• Sokeria
• Mineraaleja
• Vitamiineja
• Vettä

Valitettavasti tämä tekee siitä myös erinomaisen kasvuympäristön bakteereille, hiivoille ja sienille. Jo pieni määrä mikro-organismeja voi nopeasti vallata viljelyastian, minkä vuoksi steriiliys on välttämätöntä.

Vaihtoehto 1: Steriilisuodatus (nestemäiset alustat)

Nestemäisille alustoille steriilisuodatus on yksi luotettavimmista vaihtoehdoista.

Kalvosuodatin, jonka koko on tyypillisesti noin 0,22µm, voi poistaa suurimman osan bakteereista ja sienisoluista valmistetusta nestemäisestä alustasta. Suodatettu alusta on sen jälkeen siirrettävä steriileihin astioihin puhtaissa olosuhteissa.

Tyypillinen työvaihe näyttää tältä:

1. Valmistele neste, jonka haluat steriloida.
2. Vedä neste steriiliin ruiskuun.
3. Kiinnitä steriili 0,22 µm ruiskusuodatin ruiskuun.
4. Työnnä neste suodattimen läpi.
5. Kerää suodatettu neste suoraan steriiliin säiliöön.
6. Pidä kaikki suodattimen jälkeiset välineet steriileinä.

Tämä menetelmä on erityisen hyödyllinen seuraaville:

• Kasvien kasvunsäätelijöiden kantaliuokset
• Vitamiinit
• Lämpöherkät yhdisteet
• Nestemäiset viljelyalustat

Agaria sisältävillä alustoilla menetelmä on kuitenkin vaikeampi, koska liuos muuttuu jäähtyessään viskoosiksi.

Vaihtoehto 2: Käytä esisteriloituja astioita

Sen sijaan, että yrittäisit steriloida jokaisen komponentin itse, aloittelijat voivat yksinkertaistaa prosessia käyttämällä:

• Steriilejä viljelyastioita
• Steriilejä pipettejä
• Steriilejä suodattimia
• Esisteriloituja tarvikkeita

Tämä vähentää kontaminaation lähteiden määrää huomattavasti.

Steriilisuodatuksen yhdistäminen steriileihin kertakäyttövälineisiin voi tehdä pienimuotoisesta nesteviljelystä käytännöllistä ilman painelaitteita.

Vaihtoehto 3: Höyrysterilointi tavallisessa kattilassa (fraktioitu sterilointi)

Jos sinulla ei ole autoklaavia tai painekeitintä, voit steriloida alustat myös tavallisen kattilan höyryllä.

Aseta valmistetut alustat kuumuutta kestäviin viljelyastioihin tai pulloihin, jätä kannet hieman löysälle, jos se sopii astialle, ja aseta ne ritilälle tai korotetulle alustalle (myös alumiinifoliopallot toimivat) pienen vesimäärän yläpuolelle. Peitä kattila kannella ja anna astioiden altistua jatkuvalle höyrylle.

Koska tavallinen höyry saavuttaa vain noin 100 °C ilmanpaineessa, se on vähemmän luotettava kuin paineistettu 121-asteinen höyry. Jotkut bakteeri-itiöt voivat selviytyä yhdestä käsittelystä. Tästä syystä tulisi mieluiten käyttää toistuvia höyrytysjaksoja.

Käytännöllinen lähestymistapa on:

• Höyrytä noin 30–60 minuuttia
• Anna alustan jäähtyä ja levätä noin 24 tuntia
• Toista höyrytysprosessi
• Tee yhteensä 2–3 jaksoa

Idea on, että selviytyneet itiöt voivat itää lepojakson aikana ja ne on helpompi tuhota seuraavassa kuumennusjaksossa. Tämä vähentää kontaminaatiota merkittävästi jokaisella jaksolla.

Se ei kuitenkaan ole vieläkään yhtä luotettava kuin kunnollinen painesterilointi.

Milloin tämä menetelmä sopii?

Se voi olla hyödyllinen:

• Kudosviljelyä kokeileville aloittelijoille
• Pienille erille
• Tilanteisiin, joissa painekeitintä ei ole saatavilla
• Edullisille kotikokoonpanoille

Mutta jos tavoitteenasi on jatkuvasti alhaiset kontaminaatioprosentit, painekeitin tai autoklaavi on silti suositeltava.

Voiko kudosviljelyalustaa keittää?

Keittäminen voi tappaa monia mikro-organismeja, mutta se ei tuhoa luotettavasti kaikkia bakteeri-itiöitä. Tästä syystä keittäminen ei ole varsinaista sterilointia. Se saattaa toimia joissakin harrastajakokeiluissa, mutta kontaminaatioaste on yleensä korkeampi.

Jos tavoitteenasi on luotettava pitkäaikaisviljely, pelkkä keittäminen ei ole paras vaihtoehto.

Voiko kudosviljelyalustaa lämmittää mikroaaltouunissa?

Mikroaaltouunit voivat kuumentaa alustat nopeasti ja vähentää mikrobikontaminaatiota. Mikroaaltokuumennus on kuitenkin usein epätasaista, sillä siihen voi jäädä kylmiä kohtia, mikä tarkoittaa, että jotkut mikro-organismit voivat selviytyä. Mikroaaltouunin käyttöä tulisi siksi pitää matalamman luotettavuuden menetelmänä, ei autoklaavin korvikkeena.

Entä kemiallinen sterilointi?

Kemialliset sterilointiaineet, kuten valkaisuaine ja alkoholi, ovat erinomaisia seuraaviin:

• Työpinnat
• Työkalut
• Eksplantit

Niitä ei yleensä tulisi lisätä suoraan tavallisiin kasvikudosviljelyalustoihin.

Kontaminaation hillitsemiseen tarkoitettuja tuotteita voidaan joskus käyttää tietyissä protokollissa, mutta kontaminaatiota estävät lisäaineet eivät korvaa asianmukaista steriiliä tekniikkaa.

Helpoin lähestymistapa aloittelijalle ilman painelaitteita

Nestemäiselle alustalle (ilman hyytelöimisainetta):

1. Valmistele nestemäinen alusta.
2. Säädä pH.
3. Steriilisuodata alusta.
4. Annostele se aseptisesti steriileihin astioihin.
5. Työskentele inokuloinnin aikana liikkumattoman ilman laatikossa (still-air box) tai laminaarivirtauspöydässä.
6. Käytä steriilejä työkaluja ja tarvikkeita.

Kiinteälle alustalle (hyytelöimisaineen kanssa):

1. Valmistele alusta.
2. Säädä pH (tee tämä ennen hyytelöimisaineen lisäämistä).
3. Steriloi höyryttämällä tavallisessa kattilassa 2–3 jakson ajan (anna jäähtyä 24 tuntia jaksojen välillä).
4. Työskentele inokuloinnin aikana liikkumattoman ilman laatikossa tai laminaarivirtauspöydässä.
5. Käytä steriilejä työkaluja ja tarvikkeita.

Kannattaako painekeitin ostaa?

Kyllä, jokaiselle, joka suunnittelee kudosviljelyä säännöllisesti. Sopiva painekeitin on usein yksi suurimmista parannuksista, jonka kotikudosviljelyyn voi tehdä.

Sen avulla voit steriloida:

• Viljelyalustat
• Veden
• Lasitavarat
• Työkalut
• Astiat

yhdessä prosessissa.

Mutta aloittelijoille, jotka kokeilevat kudosviljelyä ensimmäistä kertaa, steriilisuodatus ja esisteriloidut tarvikkeet voivat tarjota vaihtoehtoisen lähtöpisteen.