Kasvin eksplanttien sterilointi kudosviljelyä varten

Kasvitilkkunen on yleensä suurin epäpuhtauksien lähde uutta kudosviljelyä perustettaessa. Kasveilla on luonnostaan bakteereja, sienien itiöitä ja muita mikrobeja pinnoillaan. Kasvitilkkunen steriloidaan sen mikrobien määrän vähentämiseksi niin, että kasvikudos voi kasvaa ilman epäpuhtauksia. Vaikeus on siinä, että sterilointikäsittelyn on tuhottava mikrobit vahingoittamatta kasvia.

Aloita terveellä kasvimateriaalilla

Sterilointi alkaa jo ennen kuin kasvitilkkunen viedään steriiliin työtilaan. Terve emokasvi tarjoaa paremman lähtömateriaalin kuin stressaantunut tai sairas kasvi.

Valitse aina kun mahdollista:

• aktiivisesti kasvavaa kudosta
• nuoria versoja
• tuhoajia vapaata materiaalia
• näkyvää mätää vaillaa materiaalia
• maaperän epäpuhtauksista erossa kasvatettua kudosta

Maaperän alla olevat rakenteet, kuten juuret, juurakot ja sipulikasvit, ovat yleensä vaikeammin sterilointiin alistettavissa.

Puhdistus ei ole samaa kuin sterilointi

Poista ennen kemiallista käsittelyä mahdollisimman paljon fyysisiä epäpuhtauksia. 

Kasvimateriaalia voidaan pestä huolellisesti vedellä ja puhdistaa seuraavista:

• maasta
• kuolleesta kudoksesta
• orgaanisista jätteistä
• vanhoista lehtitupista

Tämän materiaalin poistaminen tehostaa seuraavaa sterilointivaihetta.

Pintasterilointi

Yleisiä kasvikudosviljelyn sterilointiaineita ovat etanoli ja natriumhypokloriitti. Etanoli voi nopeasti vähentää pintamikrobeja, kun taas laimennetut natriumhypokloriittiliuokset (eli valkaisuaineet) tarjoavat pidemmän desinfiointikäsittelyn. Oikea pitoisuus ja altistusaika riippuvat suuresti kasvitilkkunesta. Pehmeä meristeemikudos voi vaurioitua käsittelyssä, jota paksu puuvartinen varsi sietää helposti. Tämän vuoksi sterilointiprotokollia tulisi käsitellä lähtökohtina, ei yleispätevinä resepteinä.

Sterili huuhtelu

Kemiallisen steriloinnin jälkeen kasvitilkkunen siirretään steriiliin työtilaan. Jäännösdisinfektiot poistetaan steriilillä vedellä. Useita huuhteluja käytetään yleensä kemikaalijäämien vähentämiseksi.

Trimmataan steriloinnin jälkeen

Kasvitilkkunen ulkopinnat ovat yleensä eniten alttiina sekä epäpuhtauksille että sterilointikemikaaleille. Kun kasvitilkkunen on steriilissä työtilassa, vaurioituneen ulkokudoksen voi poistaa steriileillä välineillä. Versojen kärjissä lehtitupit voidaan poistaa asteittain, kunnes puhtaampi sisäinen kudos paljastuu. Solmujen kohdalla varren päät voidaan trimmata uudelleen ennen inokulaatiota.

Kasvitilkkusen koko on tärkeää

Erittäin suurilla kasvitilkkunilla voi olla enemmän epäpuhtauksia. Erittäin pienet kasvitilkkunen voivat olla vaikeasti perustettavissa, koska niissä on vähemmän varastoituja resursseja ja ne vaurioituvat helpommin. Harrastuskudosviljelyssä pieni määrä tervettä kudosta meristeemin ympärillä riittää usein käytännölliseksi tasapainoksi.

Erilaiset kasvit vaativat erilaisia strategioita

Monsteralle hyvin toimiva sterilointimenetelmä ei välttämättä toimi yhtä hyvin orkidille tai Alocasia-kasvin sipulikasvustolle.

Sterilointiin vaikuttavia tekijöitä ovat:

• kudoksen paksuus
• pinnan rakenne
• karvojen läsnäolo
• kasvikohta maaperän alla
• kasvitilkkunen
• luonnollinen mikrobikuorma

Parhaat protokollat kehitetään yleensä toistuvien kokeilujen kautta.

Pidä kirjaa

Kun perustat uutta lajia, kirjaa tarkka käsittely ylös.

Huomautus:

• puhdistusmenetelmä
• disinfektiopitoisuus
• altistusaika
• huuhtelujen määrä
• kasvitilkkunen
• selviytyminen
• epäpuhtausaste

Jos useimmat viljelyt kontaminoituvat, käsittelyä voidaan tarvita vahvistettavaksi. 

Jos useimmat kasvitilkkunen kuolevat mutta pysyvät puhtaina, käsittely voi olla liian ankara.

Tavoitteena ei ole maksimaalinen sterilointi.

Tavoitteena on maksimaalinen puhdas selviytyminen.