¿Cómo esterilizar medios de cultivo de tejidos sin usar un autoclave o una olla a presión?

Uno de los mayores obstáculos para los principiantes en el cultivo de tejidos vegetales es la esterilización. Los laboratorios profesionales normalmente utilizan un autoclave, mientras que muchos cultivadores aficionados usan una olla a presión.

¿Pero qué sucede si no tienes ninguno de los dos?

Es posible realizar ciertas formas de cultivo de tejidos sin un autoclave o una olla a presión, aunque las alternativas tienen limitaciones.

¿Por qué los medios de cultivo de tejidos deben ser estériles?

Los medios de cultivo de tejidos vegetales suelen contener:

• Azúcar
• Minerales
• Vitaminas
• Agua

Desafortunadamente, esto también lo convierte en un excelente medio de crecimiento para bacterias, levaduras y hongos. Incluso una cantidad mínima de microorganismos puede apoderarse rápidamente de un recipiente de cultivo, por lo que la esterilidad es fundamental.

Opción 1: Filtración estéril (Medios líquidos)

Para los medios líquidos, la filtración estéril es una de las alternativas más fiables.

Un filtro de membrana, típicamente de unos 0.22µm, puede eliminar la mayoría de las bacterias y células fúngicas de un medio líquido preparado. El medio filtrado debe transferirse luego a recipientes estériles en condiciones de limpieza.

Un flujo de trabajo típico se ve así:

1. Prepare el líquido que desea esterilizar.
2. Aspire ese líquido con una jeringa estéril.
3. Conecte un filtro de jeringa estéril de 0.22 µm a la jeringa.
4. Empuje el líquido a través del filtro.
5. Recoja el líquido filtrado directamente en un recipiente estéril.
6. Mantenga estéril todo lo que esté después del filtro.

Este método es especialmente útil para:

• Soluciones madre de reguladores del crecimiento vegetal
• Vitaminas
• Compuestos termosensibles
• Medios de cultivo líquidos

Sin embargo, se vuelve más difícil con medios que contienen agar porque la solución se vuelve viscosa a medida que se enfría.

Opción 2: Usar recipientes preesterilizados

En lugar de intentar esterilizar cada componente usted mismo, los principiantes pueden simplificar el proceso utilizando:

• Recipientes de cultivo estériles
• Pipetas estériles
• Filtros estériles
• Consumibles preesterilizados

Esto reduce considerablemente el número de fuentes de contaminación.

Combinar la filtración estéril con equipos desechables estériles puede hacer que el cultivo líquido a pequeña escala sea práctico sin equipos de presión.

Opción 3: Esterilización por vapor en una olla normal (esterilización fraccionada)

Si no dispone de autoclave ni de olla a presión, también puede esterilizar los medios utilizando vapor de una olla de cocina normal.

Coloque los medios preparados en recipientes o frascos de cultivo resistentes al calor, mantenga las tapas ligeramente aflojadas si es adecuado para el recipiente, y colóquelos sobre una rejilla o plataforma elevada (las bolas de papel de aluminio también funcionan) por encima de una pequeña cantidad de agua hirviendo. Cubra la olla con una tapa y permita que los recipientes queden expuestos al vapor continuo.

Debido a que el vapor normal alcanza solo unos 100°C a presión atmosférica, es menos fiable que el vapor presurizado a 121°C. Algunas esporas bacterianas pueden sobrevivir a un solo tratamiento. Por esta razón, preferiblemente se deben utilizar ciclos de vapor repetidos.

Un enfoque práctico es:

• Vaporizar durante aproximadamente 30–60 minutos
• Permitir que el medio se enfríe y repose durante unas 24 horas
• Repetir el proceso de vaporización
• Realizar 2–3 ciclos en total

La idea es que las esporas supervivientes puedan germinar durante el período de reposo y ser más fáciles de eliminar durante el siguiente ciclo de calentamiento, reduciendo así la contaminación significativamente en cada ciclo.

Sin embargo, sigue sin ser tan fiable como una esterilización a presión adecuada.

¿Cuándo es adecuado este método?

Puede ser útil para:

• Principiantes que experimentan con el cultivo de tejidos
• Lotes pequeños
• Situaciones en las que no se dispone de una olla a presión
• Montajes domésticos de bajo coste

Pero si busca tasas de contaminación consistentemente bajas, una olla a presión o un autoclave siguen siendo preferibles.

¿Se puede hervir el medio de cultivo de tejidos?

Hervir puede matar muchos microorganismos, pero no destruye de forma fiable todas las esporas bacterianas. Por esta razón, hervir no es una verdadera esterilización. Puede funcionar en algunos experimentos caseros, pero las tasas de contaminación suelen ser más altas.

Si su objetivo es un cultivo a largo plazo fiable, hervir por sí solo no es la mejor opción.

¿Se puede usar el microondas para el medio de cultivo de tejidos?

Los microondas pueden calentar los medios rápidamente y reducir la contaminación microbiana. Sin embargo, el calentamiento por microondas suele ser desigual, ya que pueden quedar puntos fríos, lo que significa que algunos microorganismos podrían sobrevivir. Por lo tanto, el uso del microondas debe considerarse un método de menor fiabilidad en lugar de un sustituto del autoclave.

¿Qué hay de la esterilización química?

Los esterilizantes químicos como el cloro y el alcohol son excelentes para:

• Superficies de trabajo
• Herramientas
• Explantes

Normalmente no deben añadirse directamente a los medios de cultivo de tejidos vegetales estándar.

Los productos diseñados para suprimir la contaminación a veces pueden utilizarse en protocolos específicos, pero los aditivos para el control de la contaminación no sustituyen una técnica estéril adecuada.

El enfoque más fácil para principiantes sin equipos de presión

Para medio líquido (sin agente gelificante)

1. Prepare el medio líquido.
2. Ajuste el pH.
3. Filtre el medio de forma estéril.
4. Dispénselo asépticamente en recipientes estériles.
5. Trabaje dentro de una caja de aire en calma o en un entorno de flujo laminar al inocular medios.
6. Utilice herramientas y consumibles estériles.

Para medio sólido (con agente gelificante):

1. Prepare el medio
2. Ajuste el pH (ajuste el pH antes de añadir el agente gelificante).
3. Esterilice al vapor en una olla normal durante 2-3 ciclos (deje enfriar 24 h entre ciclos).
4. Trabaje dentro de una caja de aire en calma o en un entorno de flujo laminar al inocular medios.
5. Utilice herramientas y consumibles estériles.

¿Vale la pena comprar una olla a presión?

Para cualquiera que planee realizar cultivos de tejidos con regularidad, sí. Una olla a presión adecuada suele ser una de las mayores mejoras que se pueden hacer en un sistema de cultivo de tejidos casero.

Le permite esterilizar:

• Medios de cultivo
• Agua
• Cristalería
• Herramientas
• Recipientes

en un solo proceso.

Pero para los principiantes que prueban el cultivo de tejidos por primera vez, la filtración estéril y los suministros preesterilizados pueden proporcionar un punto de partida alternativo.