Kontamination in der pflanzlichen Gewebekultur: Ursachen, Identifizierung & Prävention
Kontamination ist eine der häufigsten Herausforderungen bei der pflanzlichen Gewebekultur. Selbst wenn eine Kultur unmittelbar nach der Inokulation vollkommen sauber aussieht, können einige Tage oder sogar Wochen später Bakterien oder Pilze auftreten.
Zu verstehen, woher die Kontamination kommt, ist eine der wichtigsten Fähigkeiten, die ein Gewebekultur-Anwender entwickeln kann.
Kontamination stammt in der Regel aus einer von drei Quellen: dem Pflanzenmaterial selbst, der Arbeitsumgebung oder den Geräten und Materialien, die während der Kultur verwendet werden.
Externe Kontamination
Die Oberfläche einer Pflanze trägt von Natur aus Mikroorganismen. Blätter, Stängel, Wurzeln und Knollen können Pilzsporen, Bakterien und andere Mikroben enthalten, die im Freien für die Pflanze harmlos sind, aber in einem nährstoffreichen Kulturgefäß zu einem ernsthaften Problem werden. Aus diesem Grund werden Explantate oberflächensterilisiert, bevor sie in die Kultur eingebracht werden. Pflanzenmaterial, das in Erde gewachsen ist, ist im Allgemeinen schwieriger zu sterilisieren als Material, das von saubererem oberirdischem Wachstum stammt.
Interne Kontamination
Einige Mikroorganismen leben eher im Inneren des Pflanzengewebes als auf der Oberfläche. Diese werden manchmal als endophytische Mikroorganismen bezeichnet. Da sie im Inneren der Pflanze geschützt sind, kann die Oberflächensterilisation sie möglicherweise nicht entfernen. Eine Kultur kann daher mehrere Tage lang sauber bleiben, bevor plötzlich Bakterien aus dem Explantat heraus zu wachsen beginnen. Dies ist ein Grund, warum die Etablierung einer sauberen Mutterpflanze vor der Gewebekultur die Erfolgsraten erheblich verbessern kann.
Kontamination durch die Arbeitsumgebung
Die Luft enthält Pilzsporen, Bakterien und Staubpartikel. Jedes Mal, wenn ein Kulturgefäß geöffnet wird, besteht die Möglichkeit, dass Mikroorganismen eindringen. Das Risiko kann verringert werden, indem man in einer sterilen Werkbank (Laminar-Flow-Box) oder einem ordnungsgemäß vorbereiteten ruhenden Arbeitsbereich arbeitet und die Kulturgefäße so kurz wie möglich offen hält.
Kontamination durch Werkzeuge
Skalpelle, Pinzetten und andere Werkzeuge müssen steril sein, wenn sie ein Explantat berühren. Ein Werkzeug, das eine nicht sterile Oberfläche berührt, kann Mikroorganismen direkt in ein Kulturgefäß übertragen. Eine gute sterile Technik erfordert daher das ständige Bewusstsein darüber, welche Oberflächen steril sind und welche nicht.
Wie sieht eine Kontamination aus?
Verschiedene Kontaminanten können sehr unterschiedlich aussehen.
Bakterielle Kontamination
Bakterien erscheinen oft als:
- trübe Bereiche im Nährmedium
- feuchtes oder schleimiges Wachstum um das Explantat herum
- durchscheinende Filme
- gelbe, cremefarbene oder weiße Kolonien
- schneller Verfall des Pflanzengewebes
Einige bakterielle Kontaminationen sind extrem subtil und können zunächst nur als schwacher Schleier um die Basis des Explantats erscheinen.
Pilzkontamination
Pilze sind in der Regel leichter zu erkennen.
Häufige Anzeichen sind:
- weißes, flaumiges Wachstum
- grauer oder schwarzer Schimmel
- feine fadenartige Strukturen
- schnell wachsende Kolonien
- gefärbte Sporen
Eine einzige Pilzkolonie kann sich überraschend schnell über ein ganzes Gefäß ausbreiten.
Hefen
Hefekontamination kann als kleine cremefarbene Kolonien oder trübes Wachstum im Nährmedium erscheinen. Sie kann manchmal mit einer bakteriellen Kontamination verwechselt werden.
Warum eine Kontamination manchmal spät auftritt
Eine Kultur, die nach drei Tagen sauber aussieht, ist nicht zwangsläufig steril. Mikroorganismen können in sehr geringer Anzahl vorhanden sein und benötigen Zeit, um sich zu vermehren, bevor sie sichtbar werden.
Interne Bakterien können ebenfalls allmählich aus dem Pflanzengewebe austreten. Aus diesem Grund sollten neue Kulturen normalerweise mehrere Wochen lang beobachtet werden, bevor sie als zuverlässig sauber eingestuft werden.
Wie man Kontamination reduziert
Eine erfolgreiche Kontaminationskontrolle beruht auf mehreren Schutzschichten:
- Verwenden Sie nach Möglichkeit gesunde Mutterpflanzen.
- Reinigen Sie das Pflanzenmaterial vor der Sterilisation gründlich.
- Verwenden Sie ein geeignetes Oberflächensterilisationsverfahren für die Art des Explantats.
- Sterilisieren Sie Kulturmedien und Gefäße ordnungsgemäß.
- Arbeiten Sie in einer sauberen Umgebung.
- Sterilisieren Sie die Werkzeuge zwischen den Explantaten.
- Minimieren Sie die Zeit, in der die Kulturgefäße offen bleiben.
- Vermeiden Sie es, sterile Oberflächen zu berühren.
- Halten Sie kontaminierte Kulturen von sauberen Kulturen fern.
Kein Sterilisationsprotokoll funktioniert perfekt für jede Art. Ein weicher junger Trieb und eine in Erde gewachsene Knolle können eine sehr unterschiedliche Behandlung erfordern.
Das Ziel ist es, ein Gleichgewicht zwischen dem Abtöten von Mikroorganismen und dem Erhalt des lebenden Pflanzengewebes zu finden.
Sollten kontaminierte Kulturen gerettet werden?
In den meisten Fällen der Hobby-Gewebekultur sollten stark kontaminierte Kulturen aus dem Kulturbereich entfernt werden. Das Öffnen eines kontaminierten Gefäßes in der Nähe sauberer Kulturen kann Pilzsporen oder Bakterien in den Arbeitsbereich freisetzen.
Wenn ein Explantat besonders wertvoll ist, kann es manchmal möglich sein, sauberes inneres Gewebe zu entnehmen und einen Neuansatz zu versuchen, aber dies sollte vorsichtig und getrennt von sauberen Kulturen erfolgen.
Die wichtigste Regel
Eine Kontamination ist nicht einfach nur ein Fehler. Jede kontaminierte Kultur liefert Informationen.
Notieren Sie:
- die Pflanzenart
- den Explantattyp
- die Sterilisationsmethode
- die Sterilisationsdauer
- das Datum der Inokulation
- die Art der Kontamination
- wie lange es dauerte, bis sie erschien
Mit der Zeit erleichtern diese Aufzeichnungen die Verbesserung Ihres Protokolls erheblich.