So bereiten Sie Pflanzengewebekulturmedien zu Hause zu
Gewebekulturmedium versorgt Pflanzen mit allem, was sie normalerweise aus dem Boden, den Wurzeln und ihrer Umgebung erhalten würden. Ein typisches Medium enthält mineralische Nährstoffe, Vitamine, Zucker, Wasser und ein Geliermittel. Je nach Zweck der Kultur kann es auch Pflanzenwachstumsregulatoren enthalten. Die korrekte Zubereitung der Medien ist wichtig, da selbst geringe Unterschiede in der Konzentration oder dem pH-Wert die Pflanzenentwicklung beeinflussen können.
Die Grundkomponenten
Basalsalze
Eines der am weitesten verbreiteten Basalmedien ist das Murashige-und-Skoog-Medium, allgemein als MS-Medium bezeichnet. MS liefert wichtige Makro- und Mikronährstoffe, darunter Stickstoff, Kalium, Calcium, Magnesium, Phosphor, Eisen und Spurenelemente. Viele kommerzielle Formulierungen enthalten zudem Vitamine.
Saccharose
Pflanzen, die in Kulturgefäßen wachsen, können sich oft nicht vollständig auf die Photosynthese verlassen. Saccharose stellt eine zugängliche Energiequelle dar. Eine Konzentration von etwa 20–30 g/l ist in vielen Protokollen üblich, obwohl die ideale Konzentration je nach Art und Kulturstadium variiert.
Agar
Agar wandelt flüssiges Medium in ein halbfestes Gel um. Dies stützt das Explantat, während Nährstoffe und Wasser weiterhin verfügbar bleiben. Die benötigte Menge hängt von der Festigkeit des verwendeten Agars ab.
Pflanzenwachstumsregulatoren
Pflanzenwachstumsregulatoren (PGRs) wie BAP, NAA und IBA können zugesetzt werden, um die Sprossbildung, Vermehrung oder Bewurzelung zu beeinflussen. Sie werden in sehr niedrigen Konzentrationen verwendet und sollten präzise abgemessen werden.
Welche Art von Wasser sollte verwendet werden?
Für konsistente Ergebnisse ist destilliertes, deionisiertes oder durch Umkehrosmose gewonnenes Wasser vorzuziehen. Leitungswasser kann unterschiedliche Mengen an Calcium, Magnesium, Bicarbonat, Natrium und anderen gelösten Mineralien enthalten. Diese Mineralien verändern die endgültige Zusammensetzung des Mediums. Weiches Leitungswasser kann in manchen Situationen funktionieren, aber gereinigtes Wasser bietet eine bessere Reproduzierbarkeit.
Zubereitung des Mediums
Beginnen Sie mit etwas weniger Wasser als dem gewünschten Endvolumen.
- Lösen Sie die Basalsalze und die Saccharose gründlich auf.
- Fügen Sie alle weiteren Komponenten hinzu, die in der Formulierung erforderlich sind (d. h. PGRs & Konservierungsmittel).
- Stellen Sie den pH-Wert vor der Zugabe von Agar ein, falls dies die in Ihrem Protokoll vorgesehene Methode ist.
- Ein pH-Wert von etwa 5,6–5,8 wird für viele Pflanzengewebekulturen üblicherweise verwendet.
- Füllen Sie die Lösung nach der pH-Einstellung auf das Endvolumen auf.
- Geben Sie das benötigte Agar hinzu und verteilen Sie das Medium auf die Kulturgefäße.
- Sterilisieren Sie das Medium 15 Minuten lang bei 15 PSI in einem Autoklaven oder Schnellkochtopf und lassen Sie es vor der Inokulation abkühlen.
Sterilisation
Das vorbereitete Medium muss sterilisiert werden, bevor Pflanzenmaterial eingebracht wird. Ein Autoklav ist die Standardmethode im Labor. Für die Gewebekultur zu Hause wird häufig ein geeigneter Schnellkochtopf verwendet, um vergleichbare feuchte Hitzesterilisationsbedingungen zu erreichen. Lassen Sie die Gefäße nach der Sterilisation abkühlen, ohne sie zu öffnen.
Warum der pH-Wert wichtig ist
Der pH-Wert des Mediums beeinflusst:
- die Nährstoffverfügbarkeit
- die Konsistenz des Agars
- die chemische Stabilität
- das Pflanzenwachstum
Ein extrem hoher oder niedriger pH-Wert kann die Verfügbarkeit einiger Nährstoffe verringern oder beeinflussen, wie das Medium erstarrt.
Häufige Fehler vermeiden
Zu den häufigen Problemen bei der Zubereitung gehören:
- ungenaues Wiegen
- falsches Endvolumen
- Vergessen der pH-Einstellung
- Verwendung von zu viel oder zu wenig Agar
- Kontamination des Mediums nach der Sterilisation
- Verwechslung von mg mit g
- ungenaues Hinzufügen konzentrierter PGRs
Bei sehr kleinen Mengen können Stammlösungen die genaue Dosierung erheblich erleichtern.
Konsistenz ist wichtiger als Perfektion
Ein wesentlicher Vorteil der Gewebekultur ist die Wiederholbarkeit. Wenn jede Charge auf die gleiche Weise zubereitet wird, lässt sich viel leichter feststellen, ob Veränderungen im Pflanzenwachstum durch die Pflanze selbst oder durch das Medium verursacht werden. Gute Aufzeichnungen sind daher genauso wertvoll wie gute Inhaltsstoffe.