Hvordan steriliserer man vævsdyrkningsmedier uden en autoklave eller trykkoger?

En af de største barrierer for begyndere inden for plantevævskultur er sterilisering. Professionelle laboratorier bruger normalt en autoklave, mens mange hobbydyrkere bruger en trykkoger.

Men hvad hvis du ikke har nogen af delene?

Det er muligt at udføre visse former for vævskultur uden en autoklave eller trykkoger, selvom alternativerne har begrænsninger.

Hvorfor skal vævskulturmedier være sterile?

Plantevævskulturmedier indeholder normalt:

• Sukker
• Mineraler
• Vitaminer
• Vand

Desværre gør dette det også til et fremragende vækstmedium for bakterier, gær og svampe. Selv et lille antal mikroorganismer kan hurtigt overtage et kulturkar, og sterilitet er derfor afgørende.

Mulighed 1: Sterilfiltrering (Flydende medier)

Til flydende medier er sterilfiltrering et af de mest pålidelige alternativer.

Et membranfilter, typisk omkring 0,22µm, kan fjerne de fleste bakterie- og svampeceller fra et klargjort flydende medium. Det filtrerede medie skal derefter overføres til sterile beholdere under rene forhold.

En typisk arbejdsproces ser således ud:

1. Forbered den væske, du ønsker at sterilisere.
2. Træk væsken op i en steril sprøjte.
3. Sæt et sterilt 0,22 µm sprøjtefilter på sprøjten.
4. Pres væsken gennem filteret.
5. Opsaml den filtrerede væske direkte i en steril beholder.
6. Hold alt efter filteret sterilt.

Denne metode er særligt nyttig til:

• Stamløsninger af plantevækstregulatorer
• Vitaminer
• Varmefølsomme forbindelser
• Flydende kulturmedier

Det bliver dog sværere med agar-holdige medier, fordi opløsningen bliver tyktflydende, når den køler af.

Mulighed 2: Brug præ-steriliserede beholdere

I stedet for selv at forsøge at sterilisere hver komponent, kan begyndere forenkle processen ved at bruge:

• Sterile kulturbeholdere
• Sterile pipetter
• Sterile filtre
• Præ-steriliserede forbrugsstoffer

Dette reducerer antallet af kontamineringskilder betydeligt.

Ved at kombinere sterilfiltrering med sterilt engangsudstyr kan flydende kulturer i lille skala gøres praktiske uden trykudstyr.

Mulighed 3: Dampsterilisering i en almindelig gryde (fraktioneret sterilisering)

Hvis du ikke har en autoklave eller trykkoger, kan du også sterilisere medier ved hjælp af damp fra en almindelig gryde.

Placer de forberedte medier i varmebestandige kulturbeholdere eller flasker, hold lågene en smule løsnede, hvis det er passende for beholderen, og placer dem på en rist eller en forhøjet platform (alufoliekugler fungerer også) over en lille mængde kogende vand. Dæk gryden med et låg og lad beholderne blive udsat for konstant damp.

Da almindelig damp kun når omkring 100°C ved atmosfærisk tryk, er det mindre pålideligt end damp under tryk ved 121°C. Nogle bakteriesporer kan overleve en enkelt behandling. Af denne grund bør man fortrinsvis bruge gentagne dampcyklusser.

En praktisk fremgangsmåde er:

• Damp i cirka 30–60 minutter
• Lad mediet køle af og hvile i cirka 24 timer
• Gentag dampprocessen
• Udfør 2–3 cyklusser i alt

Tanken er, at overlevende sporer kan spire i hvileperioden og blive lettere at dræbe under den næste opvarmningscyklus. Dette reducerer kontaminering betydeligt for hver cyklus.

Det er dog stadig ikke så pålideligt som korrekt tryksterilisering.

Hvornår er denne metode velegnet?

Den kan være nyttig til:

• Begyndere, der eksperimenterer med vævskultur
• Små portioner
• Situationer, hvor der ikke er adgang til en trykkoger
• Billige hjemmeopsætninger

Men hvis du sigter efter konsekvent lave kontamineringsrater, er en trykkoger eller autoklave stadig at foretrække.

Kan man koge vævskulturmedier?

Kogning kan dræbe mange mikroorganismer, men det ødelægger ikke pålideligt alle bakteriesporer. Af denne grund er kogning ikke sand sterilisering. Det kan fungere i nogle hobbyeksperimenter, men kontamineringsraterne er normalt højere.

Hvis dit mål er pålidelig langtidskultur, er kogning alene ikke den bedste løsning.

Kan man bruge mikrobølgeovn til vævskulturmedier?

Mikrobølgeovne kan opvarme medier hurtigt og reducere mikrobiel kontaminering. Opvarmning i mikrobølgeovn er dog ofte ujævn, da der kan opstå kolde områder, hvilket betyder, at nogle mikroorganismer kan overleve. Mikrobølgeovn bør derfor betragtes som en metode med lavere pålidelighed snarere end en erstatning for en autoklave.

Hvad med kemisk sterilisering?

Kemiske sterilisationsmidler såsom blegemiddel og alkohol er fremragende til:

• Arbejdsflader
• Værktøj
• Explants (plantevævsstykker)

De bør normalt ikke tilsættes direkte til standard plantevævskulturmedier.

Produkter designet til at undertrykke kontaminering kan nogle gange bruges i specifikke protokoller, men tilsætningsstoffer til kontamineringskontrol erstatter ikke korrekt steril teknik.

Den nemmeste begynderfremgangsmåde uden trykudstyr

Til flydende medie (uden geleringsmiddel)

1. Forbered flydende medie.
2. Juster pH-værdien.
3. Sterilfiltrer mediet.
4. Fordel det aseptisk i sterile beholdere.
5. Arbejd inde i en "still-air box" eller et miljø med laminart flow, når du inokulerer medier.
6. Brug sterilt værktøj og sterile forbrugsstoffer.

Til fast medie (med geleringsmiddel):

1. Forbered medie
2. Juster pH-værdien (juster pH før tilsætning af geleringsmiddel).
3. Dampsteriliser i en almindelig gryde i 2-3 cyklusser (lad køle af i 24 timer mellem cyklusserne).
4. Arbejd inde i en "still-air box" eller et miljø med laminart flow, når du inokulerer medier.
5. Brug sterilt værktøj og sterile forbrugsstoffer.

Er en trykkoger værd at købe?

For alle, der planlægger at udføre vævskultur regelmæssigt: Ja. En passende trykkoger er ofte en af de største opgraderinger, man kan give sin vævskulturopsætning derhjemme.

Den gør det muligt for dig at sterilisere:

• Kulturmedier
• Vand
• Glasudstyr
• Værktøj
• Beholdere

i én enkelt proces.

Men for begyndere, der tester vævskultur for første gang, kan sterilfiltrering og præ-steriliserede forsyninger give et alternativt startpunkt.